使用 Minimate 超滤膜包替代搅拌式细胞系统可提高生产力

简介

超滤可维持生物活性及缩短时间

蛋白纯化技术已从样品浓缩化学沉淀或缓冲液置换透析等多样化方式朝向利用超滤膜进行压力驱动的纯化切向流系统发展。超滤 (UF) 技术依靠具有高度明确孔径的高分子薄膜依据分子量进行分离。简单来说,UF 过程依靠液体压力驱动较小的分子通过 UF 滤膜,同时截留较大的分子。

虽然可通过化学沉淀进行蛋白质样品浓缩,但由于超滤分离基于不同于化学反应的机制,因此研究者无需添加变性溶剂或盐即可进行样品浓缩。利用透析技术的缓冲液置换需使用大量缓冲液,由于扩散是唯一作用于溶液的力,这一过程可能需要数天。与需要进行大量的额外处理的许多其它技术不同,超滤装置已预先装配好且使用简单,并可快速完成浓缩或缓冲液置换过程。

利用切向流优化超滤过程

超滤可实行两种操作模式:直流过滤 (DFF),或切向流过滤(TFF,图 1)。DFF 可使用离心机很好的处理小容量(不超过 30 毫升)样品,但同时,DFF 技术可能深受滤膜污垢 (1) 问题之害。为减少凝胶层的形成,可通过配置浮动搅拌棒(磁力搅棒)或制造受到控制的层流在滤膜的上游部分生成切向流。虽然搅拌操作倾向于提高 UF 性能,但由于
 







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搅动速率及后续搅动程度均依赖搅拌棒的挥动,而后者则会在挥动的半径范围内变化,因此在实现最佳性能上有所局限。

图 1

DFF 与 TFF 的图形比较

(A) 样品溶液流过进料通道后既沿着(成切线)滤膜表面流动也流过滤膜。切向流避免了可能在滤膜表面形成污垢的分子堆积。
(B) TFF 过程防止了直流过滤中容易出现的流速快速降低现象,每单位滤膜面积因而可处理更多样品。


(A) 进料被引入滤膜。大于滤孔的分子堆积在滤膜表面形成凝胶,并形成表面污垢,堵住滤膜,使液体无法通过。
(B) 随着过滤样品量的增加,污垢随之增加,流速随之快速降低。

使用 Minimate  超滤膜包优化切向流性能

与搅拌技术相比,TFF 处理不仅可复制、易于控制,还可进行监控 (4)。总的来说,TFF 操作可使样品流在滤膜表面形成稳定平缓的再循环,从而有效控制滤膜污垢的产生。对整个滤膜面积的有效利用可大幅提大流量,从而减少加工时间,提高生产力。Minimate 超滤膜包已预先装配,即时可用,无需用户介入即可加工多达 1 升的容量。与之相比,大多数搅拌细胞装置的加工容量仅 350 毫升或更低,且必须重复开启,造成完整性失败的危险,并需要高昂的技术员操作时间成本。与搅拌装置相比,我们的 Minimate 超滤膜包无论进行简单的浓缩方案或更复杂的酶纯化加工都可节省大量的时间。

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材料与方法

Minimate TFF 超滤膜包

Minimate TFF 超滤膜中装有 Omega 超滤膜(聚醚砜),为独立性装置,可提供范围广泛的分子量截留。使用 Minimate 囊式过滤器,无需用户介入即可将多达 1 升的一批样品浓缩至仅 5 毫升。这款可重复使用/一次性超滤膜包可在闭合回路连接中使用相同装置实施一步到位或分步骤的浓缩/洗滤过程。多种蠕动泵可用于 TFF 加工。

Minimate 超滤设置
切向流过滤:Minimate 超滤设置

搅拌装置

市场上可购买到的标准搅拌装置需根据制造商的指导进行组装、操作和清洗。与 TFF 在操作上的主要区别之一是其需要压力容器或液氮罐来制造所需的压力。另外,如需进行洗滤,则搅拌装置要求研究者在使用过程中对装置进行独立组装、开启、注满及拆卸。

技术数据 Minimate 搅拌细胞
有效过滤面积 50 cm2 (0.05 ft2) 28.7 cm2 (0.03 ft2)
推荐切向流流速 40-50 mL/min 不适用
操作温度范围 5-50 °C (41-122 °F) 5-50 °C (41-122 °F)
最大操作压力 4 巴 (60 psi) 400 kPa 55 psi (N2 或过滤空气)
系统工作量(进料/回流) 5-10 mL 5-10 mL

表 1:

带有泵、压力表、回流螺旋钳、储液罐和管道连接的 Minimate TFF 囊式过滤器系统
带有泵、压力表、回流螺旋钳、储液罐和管道连接的 Minimate TFF 囊式过滤器系统

使用 Minimate 囊式过滤器进行简单启动

易于使用的 Minimate 囊式过滤器可连接至蠕动泵系统并在回流通道中产生切向流。可在《维护及使用指南》及其它列出的出版物中(2、3 和 5)查看有关 Minimate 设备操作及调整的详细及完整协议。简短的操作概述:

设置
  1. 将所有需要的管子连接至囊式过滤器,保持尽可能短的长度,以减少系统工作体积。在囊式过滤器的进料口安装压力表。
  2. 校准蠕动泵至需要的流速。
  3. 轻微抬高囊式过滤器的回流侧,帮助清除空气。
  4. 将螺旋钳松散的附着在回流管上。

处理
  1. 将需要过滤的溶液放入进料储存器并将回流和滤出线导向单独的容器。用泵使溶液以 40 毫升/分钟的流速流过囊式过滤器。
  2. 在与系统滞留容积 (10 毫升) 相当的流体流过回流及滤出线后,将回流线放回进料储存器并将滤出线放入单独容器。
  3. 继续处理直至达到所需浓度。如果需将 500 毫升溶液浓缩至 5X,请在进料储存器中剩下 100 毫升时停止过滤。
  4. 向样品储存器 (2) 中添加新鲜的缓冲液,进行洗滤(可选)。
  5. 如果回流量小于 10 毫升,可使用 15 毫升注射器收集回流,进行最后浓缩时放慢抽泵速度以避免产品起泡。

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结果及讨论

使用 Minimate 设备提高产量

处理时间是整体设备性能的一个方面。Minimate 10K Omega 囊式过滤器的处理操作被直接与使用含有 hi-flow PES 或再生纤维素膜的可比较搅拌细胞配置的相似处理条件进行比较。为展示两种配置在处理时间上的差别,进行了一个将 1 升 2 毫克/毫升 BSA 浓缩至十倍 (100 毫升) 的实验。在这些操作条件下,使用 Minimate 囊式过滤器仅在刚超过一小时的时间内即完成处理(图 2)。与之相比,不考虑膜配置的情况下,搅拌细胞设备需要五倍更长的处理时间。除了需要较长的处理时间,搅拌细胞设备还需要用户以重复填充周期的方式介入操作。

图 2

使用 Minimate 囊式过滤器可大幅减少处理时间
切向流过滤:使用 Minimate 囊式过滤器可大幅减少处理时间 

一份 2 毫克/毫升 BSA 溶液通过 350 毫升搅拌细胞装置或 Minimate 囊式过滤器被浓缩至十倍(1000 至 100 毫升)。Minimate 中含有预组装的 Omega 10K 膜。使用回流回路背压将切向流设置在 50 毫升/分钟,以产生约 15 毫升/分钟的初始滤出。搅拌细胞装置使用聚醚砜 (PES) 或再生纤维素 (RC) 盘,并使用 55 psi 的过滤气体进行增压,造成 6 mL/min 的起始滤出流速。误差条显示五次独立操作的标准偏差。

测量小部分滤出及回流的 260 nm 吸收率为蛋白浓缩过程提供了验证。据观察,使用搅拌细胞装置时 BSA 在处理过程中通过 10K PES 膜漏出,显示出完整性故障。随后,为确保对两种配置进行统计上显著的比较,我们进行了额外实验,直到完成了五次成功的搅拌细胞操作。

处理及设备完整性

处理中的完整性故障不仅会造成时间损失,还可能破坏宝贵的样品。Minimate 装置为密封的独立囊式过滤器,无需终端用户组装。使用 TFF,仅需一步即可处理 1 升蛋白样品,降低了干扰样品的风险。与之相比,SC 装置则组装复杂,UF 滤膜盘被置于设备平台,需要用螺丝固定,而这个动作可能造成泄漏或旁路。大量漏出的情况很容易从不正常的高滤出流速中发现。但更关键的是,局部旁路可能看起来像是正常运行,但造成的蛋白损失直到已造成严重后果、甚至操作结束时都无法被检测出。

通过对滤出进行蛋白质旁路监控,我们观察到搅拌细胞操作中的竞争性 PES 膜出现了严重的完整性故障(图 3)。Minimate TFF 及再生纤维素搅拌细胞装置均为完整,然而竞争性 PES 膜在 10 次操作中的 5 次分别在不同处理阶段出现故障。

图 3

经过预组装的 Minimate 可排除完整性故障
完整的 Minimate TFF 及再生纤维素搅拌装置 

我们按照图 2 中的描述进行了样品浓缩。将等量的起始材料、最终回流以及最终滤出池进行蛋白浓缩分析 (280 nm)。我们将平均浓度进行标绘,且误差条显示标准偏差分别为 (5 - Minimate)、(10 - SC PES) 和 (5 - SC RC)。为图中显示方便,回流值被标示于 Y2 轴,以反映处理中发生的十倍浓缩过程。

环氧酶-2 (COX-2) 纯化

Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) 进行了一项比较研究,以证实与使用搅拌细胞配置相比,使用 Minimate 囊式过滤器进行组织匀浆中的 Ovine COX-2 酶纯化的优势(表 1)。他们很轻松地开发出一种新的方案以代替酶生产过程中的搅拌装置。他们发现,从 TFF 过程中取得的 COX-2 比活与从他们之前一直使用的搅拌装置中得到的相符。但最关键的一点是,TFF 的处理时间减少至近三分之一,导致转换时还可进行第二次操作。

Cayman COX-2 方案中同时使用了 颇尔 Ultrasette 和 Minimate 装置:
  1. 缓冲液中的同质化羊子叶。
  2. 4 °C 下 20 分钟 10,000 x g 处理的离心机匀浆。
  3. 4 °C 1 小时 100,000 x g 处理的离心机上层清液。
  4. 含有 1% Tween 20 的溶解缓冲液中的再次悬浮微粒体颗粒。
  5. 4 °C 下搅拌 1 小时进行溶解。
  6. 4 °C 下 1 小时 100,000 x g 离心机处理。
  7. 使用带 30K MWCO 膜的 颇尔 Ultrasette 在 4 °C 下进行上层清液浓缩。将 300 毫升浓缩至 10 毫升,之后用 DE-53 柱缓冲液稀释至 100 毫升。
  8. 将样品加载至 DE-53 阴离子交换柱,清洗,并使用 pH 梯度进行酶洗脱。
  9. 使用 Minimate 超滤膜包或包含 30K MWCO 膜的搅拌装置进行洗脱液浓缩。将 350 毫升浓缩至 6 毫升,之后用 3 毫升缓冲液清洗滤膜。
  10. 将浓缩物加载至 Sephadex G-200 分级柱进行最后处理。

Table 1

环氧酶-2 竞争性测试

独立纯化 搅拌细胞 1 搅拌细胞 2 搅拌细胞 3 Minimate 1 Minimate 2 Minimate 3
初始蛋白浓度 (mg/mL) 15.0 14.5 15.0 13.6 14.1 14.7
初始比活 (U/mg) 66.7 62.1 70.9 73.5 67.4 74.8
浓缩倍数 50 46 50 40 44 41
最终比活 220 196 191 200 217 206
最终产量(SA/mg 总蛋白质) 0.048 0.045 0.043 0.042 0.044 0.040
处理时间(小时) 8.0 8.0 8.0 2.5 2.5 2.5

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结论

易于使用的 Minimate TFF 系统是不超过 1 L 样品的缓冲液置换或蛋白浓缩的最快速、可靠的选择。独立式 TFF 囊超滤膜包可清洁并再次使用,因此可节省设置及操作时间 (5)。相比之下,搅拌系统需要组装,操作较慢,需要更多监控,且在处理最多 1 L 样品时必须填充多次。在这篇论文中,我们观察到 Minimate 超滤膜包浓缩 1 升蛋白溶液的速度比可比较的搅拌系统系统快五倍。这一发现得到一名独立研究员的进一步证实,他发现环氧-2 酶纯化的处理时间减少超过三倍,同时未损伤蛋白活性。

Minimate TFF 超滤膜包不仅是少量加工(< 1 升)的有力工具,大量加工也可通过多路复接和平行配置多台 Minimate TFF 超滤膜包来实现。另外,Minimate TFF 囊式过滤器设置了与较大 TFF 装置相同的流径长度,扩展至实验室以上的中试及工厂规模时可节省宝贵的优化时间。

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参考文献

  1. L. Schwartz 和 K. Seeley, 2002。用于实验室和工艺开发应用的切向流过滤简介。颇尔 科技报告,PN 33213。
  2. L. Schwartz,2003。洗滤:一种生物样品脱盐或缓冲液置换的快速有效方法。颇尔 科技报告,PN 33289。
  3. L. Schwartz,2003。通过透析、凝胶过滤或洗滤进行脱盐和缓冲液置换。颇尔 科技报告,PN 33290。
  4. J. Jenco、T. Hu、L. Schwartz 和 K. Seeley,Minimate TFF 囊式过滤器与液体层析系统的结合通过内在监控促进了实验室规模纯化及工艺开发技术报告。
  5. Minimate 维护及使用手册,仅电子版;见 Minimate TFF 产品包装中附赠的 CD。