MicroFunnel ST 过滤漏斗用于除菌检测应用 存在/不存在和回收率检测方案

1.0 目的

本测试是为了验证 MicroFunnel ST 过滤漏斗产品是否适用于除菌检测应用,以及是否会回收本方案中规定的药典生物体。

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2.0 范围

使用 USP-24 和 EP-2000 中所列生物体,在 MicroFunnel 过滤漏斗中进行存在/不存在(直接传输)以及微生物回收研究。将针对每个生物体对三批 MicroFunnel ST 过滤漏斗进行检测(三次)。

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3.0 参考

3.1 USP24 <71> 除菌检测

3.2 USP24 <1227> 药典文章的微生物回收验证

3.3 EP 2000 2.6.1. 除菌

3.4 水和废水检查的标准方法(1995 年第 19 版)


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4.0 样品要求

三个单独批次中每一批的 150 MicroFunnel ST 过滤漏斗将针对每个测试用生物体对每批 MicroFunnel ST 过滤漏斗进行评估(三次)。

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5.0 材料

5.1 测试用生物体

大肠杆菌,ATCC 8739

绿脓杆菌,ATCC 9027

金黄葡萄球菌,ATCC 6538P

枯草杆菌,ATCC 6633

生孢梭菌,ATCC 19404(或生孢梭菌,ATCC 11437)

白色念珠菌,ATCC 10231

黑曲霉,ATCC 16404

5.2 设备

真空歧管

涡旋搅拌器

恒温箱,32.5 ± 2.5 °C 和 22.5 ± 2.5 °C

水浴,45 ± 1°C

魁北克菌落计数器

培养皿,15 X 100 毫米和 15 X 150 毫米

移液器,1 毫升和 10 毫升,除菌

移液器,1000 微升

冰水浴

厌氧罐或袋

体视显微镜

5.3 种介质和试剂

大豆酪蛋白消化 (SCD) 琼脂

厌氧琼脂

大豆酪蛋白消化培养基,200 毫升瓶,除菌

流体硫乙醇酸盐培养基 (FTM),

200 毫升瓶,除菌

盐溶液 (0.9% NaCl),除菌

除菌 0.1% 蛋白胨水

除菌盐溶液 TS 包含

0.05% 聚山梨酯 80

除菌 0.1% 蛋白胨水,含 0.05 - 0.1% 吐温 80。


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6.0 程序

6.1 生物制备

6.1.1 基于标准实验室实践的药典生物繁殖生长。

6.1.2 稀释每种生物体悬浮液,获得每毫升小于 100 菌落形成单位的密度。对非孢子形成的好氧微生物使用除菌盐溶液,对孢子形成细菌和真菌孢子悬浮液使用含 0.05% 聚山梨酯 80 的除菌盐溶液 TS。

6.2 漏斗分析

6.2.1 从一批中打开三个 MicroFunnel ST 过滤漏斗进行测试,并将装置直接放到歧管。可以使用带 #8 瓶塞的蓝色适配器作为替代方案。

6.2.2 将 100 毫升的除菌冲洗液分配至每个 MicroFunnel ST 过滤漏斗中。对非孢子形成的好氧微生物使用除菌 0.1% 蛋白胨水,对孢子形成细菌和真菌孢子悬浮液使用包含 0.1% 吐温 80 的除菌 0.1% 蛋白胨水。更换过滤漏斗盖子,施加真空,以允许流体排出并关闭真空。

6.2.3 重复步骤 6.2.2。

6.2.4 将 100 毫升的除菌冲洗液分配至每个 MicroFunnel ST 过滤漏斗中。对非孢子形成的好氧微生物使用除菌 0.1% 蛋白胨水,对孢子形成细菌和真菌孢子悬浮液使用包含 0.1% 吐温 80 的除菌 0.1% 蛋白胨水。

6.2.5 使用 1.0 毫升的移液管或同等装置,将 1.0 毫升的测试用生物悬浮液分配至每个过滤器单元。

6.2.6 更换过滤漏斗盖子,施加真空,以允许流体排出并关闭真空。

6.2.7 从第一个 MicroFunnel ST 测试用漏斗对膜进行检索,方法为:去除盖子,轻轻挤压漏斗滚筒直至它脱离底座,然后使用酒精火烧钳轻轻抬起膜的边缘,小心不要触及有效过滤面积。

6.2.8 采用滚动方式,将膜沿右上方平铺在预浇琼脂板的表面,以避免膜下含有任何气泡。对好氧微生物采用 SCD 琼脂板,对梭菌属采用厌氧琼脂板。

6.2.9 使用 6.2.7 中描述的方法从第二个 MicroFunnel ST 测试用漏斗对膜进行检索,并使用无菌技术将膜侵入 200 毫升的 FTM 瓶。

6.2.10 使用 6.2.7 中描述的方法从第三个 MicroFunnel ST 测试用漏斗对膜进行检索,并使用无菌技术将膜侵入 200 毫升的 SCD 培养基瓶。然而,没有必要将梭菌属浸入 SCD 培养基。

6.3 MicroFunnel ST 过滤漏斗批次内的复制品测试

6.3.1 通过恢复和存在/不存在方法对每一批次的 MicroFunnel ST 过滤漏斗实施三次复制品测试。

6.3.2 通过恢复和存在/不存在方法对三个批次 MicroFunnel ST 过滤漏斗的性能进行评估。

6.3.3 重复 6.2 中列出的步骤,直至完成三个批次 MicroFunnel ST 过滤漏斗的所有复制品测试。

6.3.4 重复 6.2 中列出的步骤,直至三个批次 MicroFunnel ST 过滤漏斗的所有生物均已经过三份复制品评估。

6.4 控制

6.4.1 接种物计数:通过将 1.0 毫升生物悬浮液分配至单独的除菌培养皿中,针对步骤 6.1.2 中制备的每种生物悬浮液准备五到十个密度控制板。加入约 20 毫升已冷却至约 45 - 48 °C 的熔融琼脂,通过在两个方向上仔细搅拌数次进行混合,然后让琼脂凝固。对梭菌属采用厌氧琼脂,对所有其他生物采用 SCD 琼脂。

6.4.2 促生长控制:使用适用的生物或两种测试用生物直接接种每个批次中的每种介质(培养基和琼脂)。培养方法如第 6.5 节所示。

6.4.3 介质无菌控制:对于每个批次中用于评估的每种琼脂和培养基介质,至少培养两份未经接种的复制品。

6.4.4 冲洗液/膜负极控制:通过四份 MicroFunnel 过滤漏斗过滤每批 300 毫升的冲洗液。将两个过滤器分别置于厌氧琼脂和 SCD 琼脂,另将一个过滤器侵入 SCD 培养基,并将剩余过滤器全部浸入 FTM。培养方法如第 6.5 节所示。针对使用的每批过滤器或 MicroFunnel 重复这些控制。

6.4.5 冲洗液/膜正极控制:通过双份 MicroFunnel ST 过滤漏斗过滤每批 300 毫升用作冲洗液的蛋白胨水,将其中一份浸入 SCD 培养基,将另一份浸入 FTM,然后使用测试生物悬浮液进行接种。针对使用的每种生物重复这些步骤。

6.5 培养

6.5.1 在温度为 32.5 ± 2.5 °C 的厌氧条件下将厌氧琼脂板培养最多 7 天。定期查看成长情况,并在菌落清晰可见时实施菌落计数。可以使用体视显微镜来帮助可视化膜上,或浇注板的魁北克计数器上的菌落。

6.5.2 Incubate B. subtilus, C. albicans, and A. niger organisms cultured on SCD agar plates at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期查看成长情况,并在菌落清晰可见时实施菌落计数。可以使用体视显微镜来帮助可视化膜上,或浇注板的魁北克计数器上的菌落。

6.5.3 Incubate E. coli, P. aeruginosa, and S. aureus organisms cultured on SCD agar plates at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期查看成长情况,并在菌落清晰可见时实施菌落计数。可以使用体视显微镜来帮助可视化膜上,或浇注板的魁北克计数器上的菌落。

6.5.4 SCD 培养基

6.5.4.1 Incubate SCD broth inoculated with E. coli, P. aeruginosa, and S.aureus organisms at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 3 days.定期查看浑浊度。

6.5.4.2 Incubate SCD broth inoculated with B. subtilus, C. albicans, and A. niger at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 5 days.定期查看浑浊度。

6.5.5 FTM

6.5.5.1 Incubate FTM inoculated with E. coli, P. aeruginosa, C. sporogenes, and S. aureus at 32.5 ± 2.5 °C for a maximum of 3 days.定期查看浑浊度。

6.5.5.2 Incubate FTM broth inoculated with B. subtilus, C. albicans, and A. niger at 22.5 ± 2.5 °C for a maximum of 7 days.定期查看浑浊度。


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7.0 结果

7.1 记录从滤膜过滤器中获得的菌落数目和菌落形态特征。

7.2 使用魁北克计数器计算浇注板上的菌落数。检查水及废水的参考标准方法,当前版本,9215 章 A.8 计算及记录。

7.3 查看 FTM 和 SCD 培养基的浑浊度并记录结果。有关测试样品的生长是否与控制相同的评论。

7.4 计算

7.4.1 计算每个有机体、MicroFunnel ST 测试样品批次及控制膜的平均数。

7.4.2 计算每个计算出的平均值的标准误差、σ 和 cV。
cV = ( σ ÷ x ) ( 100 )

7.4.3 计算 SCD 浇注板密度控制(接种物计数)的平均值和标准误差。

7.4.4 计算 MicroFunnel 样品及控制膜的回收百分比:

回收百分比 =   膜平均值   x 100

接种物计数平均数

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8.0 限制和结论

8.1 每批 MicroFunnel ST 测试漏斗的回收百分比必须大于等于密度控制的 70%,才可考虑用作除菌测试漏斗。

8.2 如果一个样品组的 cV 大于 20%,则基于该介质的该组测试应视为无效,并需重复测试。

8.3 如果介质控制组的 cV 大于 20%,则基于该介质的整个测试(所有测试漏斗和控制)可视为无效。

8.4 如果一组密度板的 cV 大于 20%,则使用该特定有机体悬液的整个测试可视为无效。

8.5 对于存在/不存在测试,测试培养基的生长必须与控制培养基获得的生长相等。如果所有测试样品均显示全部微生物的大量增长,则这种方法可视为有效。

8.6 每批 MicroFunnel ST 测试样品的 SCD 培养基及 FTM 的所有接种空白应可观察到浑浊度,方可考虑用作除菌测试漏斗。

8.7 直接将测试悬液接种到 SCD 培养基或 FTM 以产生浑浊效应失败将造成无效测试,必须重复进行。

8.8 所有其它阴性及阳性控制应产生预期反应。报告任何差异。


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订购须知

MicroFunnel ST 过滤漏斗
产品编号 描述 孔径
4750 MicroFunnel ST,带 Supor¨ 450 膜,平面,除菌,100 毫升容量 0.45 微米
4751 MicroFunnel 300 ST,带 Supor 450 膜,平面,除菌,300 毫升容量 0.45 微米
4811 MicroFunnel ST,带 GN-6 Metricel¨ 膜,网格,除菌,100 mL 容量 0.45 微米
4812 MicroFunnel 300 ST,带 GN-6 Metricel 膜,平面,除菌,300 毫升容量 0.45 微米
包装提示:

100 毫升漏斗(每箱 40 件):每个外包装袋中共 10 个单独包装的漏斗,每箱共 4 个外包装袋。

300 毫升漏斗(每箱 20 件):每个外包装袋中共 5 个单独包装的漏斗,每箱共 4 个外包装袋


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